关于RNA-seq中的计数标准化及其相关的标准化指标包括RPKM、FPKM、TPM和C(R)PM
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众所周知,在RNA seq测序流程中,完成测序后的主要目标是通过所得数据识别差异表达基因并进一步开展潜在功能的分析。因此,在进行差异分析及表达量评估时,对原始基因Count数据进行标准化处理,以消除因基因长度和测序深度带来的偏差,是至关重要的步骤。
在RNAseq测序过程中,一个基因的Count数值主要依据其外显子区域所匹配到的读数数量来计算。由此可知,基因长度越长,则匹配至其外显子上的Count值往往越高。此外,测序深度也会影响Count数值,即每百万碱基所检测到的读数数量。随着测序深度的增加,整个RNA seq样本中的Read count值也会相应提升。因此,在进行差异分析及表达量研究时,必须对基因长度和测序深度两个因素进行标准化处理,以去除它们所带来的干扰因素,从而更准确地判断基因在不同样本间的实际表达差异。
至此我们已经认识到,在RNA seq中对Count数值进行标准化的重要性。接下来需要了解的是常用的标准化方法:
常用的标准化方法包括
1.C(R)PM究竟指什么呢?在常见的分析中,它出现在那里呢?
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