宏基因组测序实验分析

宏基因组测序实验分析方法**-功能分析基于reads**

1 使用ctab法或相应试剂盒提取样本中的总 DNA；

DNA样品经检测确认无误后,通过Covaris超声波破碎仪进行随机片段打断,随后进行末端修复处理,附加测序连接端,随后经过纯化处理,并通过PCR技术扩增目标片段,最终完成完整的文库制备流程

采用 Illumina NovaSeq 平台实施宏基因组测序，并通过高通量测序技术准确获取样品中各物种的完整遗传信息；

4 对数据进行质控及去宿主处理：通过KneadData软件对原始数据实施质量控制（基于Trimomatic）以及去除宿主序列（基于Bowtie2）。在KneadData处理前及处理后, 使用FastQC评估质量控制的合理性和效果。

5 物种注释：采用Kraken2及自建微生物核酸数据库（从NCBI NT核酸库与RefSeq全基因组库中选取细菌、真菌、古菌及病毒的序列）进行比对分析以计算样本中的物种序列数量，并进一步通过Bracken技术估计样本中各物种的实际丰度。

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基于物种丰度数据表及功能丰度数据表的基础上展开研究，在开展物种丰度聚类分析的同时可执行PCoA与NMDS等降维方法（仅针对物种层面），完成样品间的群落结构聚类分析；若研究样本具备分组信息时，则可进一步实施LEfSe生物标志物挖掘以及代谢通路对比分析，并深入探究样本间在物种构